ChIP原理及應(yīng)用

ChIP實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控因子結(jié)合的DNA和組蛋白結(jié)合的NDA操作上最大的區(qū)別是什么？

ChIP實(shí)驗(yàn)中由于組蛋白在染色質(zhì)中表達(dá)相對(duì)較高，表達(dá)也較穩(wěn)定，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達(dá)水平很低，往往是瞬時(shí)表達(dá)。所以組蛋白研究起來更為容易，一般需要105-106個(gè)細(xì)胞即可完成一個(gè)ChIP反應(yīng)。研究起始樣本量（細(xì)胞，組織）要是組蛋白的10倍，一般每個(gè)反應(yīng)至少需要107個(gè)細(xì)胞。另外有些轉(zhuǎn)錄因子比較大，往往結(jié)合多個(gè)核小體，因此在染色質(zhì)斷裂的時(shí)候，不太適合使用酶法的處理方式，建議使用超聲斷裂染色質(zhì)的方法。因?yàn)槊阜ㄊ腔瘜W(xué)處理，消化的位點(diǎn)往往比較均一，多是在核小體的連接處，酶消化有可能將核小體斷裂的同時(shí)打斷轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合。

ChIP實(shí)驗(yàn)中使用超聲方法斷裂染色質(zhì)溫度不易控制，可能會(huì)使蛋白變性，影響ChIP結(jié)果，有沒有較好的優(yōu)化方案？

ChIP實(shí)驗(yàn)中超聲的優(yōu)化一般從如下幾個(gè)方面考慮：

1 不建議重復(fù)已發(fā)表的剪切方案而不進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)儀器不同于文獻(xiàn)中所使用的儀器時(shí)，尤其如此。

2 目前有各種超聲破碎儀器，水浴和基于探頭的。在使用基于探頭的超聲破碎儀時(shí)，選擇一個(gè)適用于您的樣品體積的探頭。

3 在任何情況下，剪切參數(shù)都應(yīng)當(dāng)根據(jù)您的樣品體積、細(xì)胞密度和細(xì)胞類型而優(yōu)化。

4 優(yōu)化應(yīng)當(dāng)包括功率設(shè)置（超聲時(shí)間 vs. 間隙時(shí)間/休息時(shí)間）以及獲得長度為200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循環(huán)數(shù)，每個(gè)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)只優(yōu)化一種參數(shù)；

5 注意時(shí)間和功率設(shè)置。過度破碎和太高功率設(shè)置會(huì)損害在免疫沉淀步驟中的表位。降低ChIP信號(hào)。

6 始終保持裂解液冰冷，間斷超聲，而不是連續(xù)，因?yàn)槌曁幚懋a(chǎn)生熱量會(huì)使染色質(zhì)變性。

7 在超聲破碎過程中避免氣泡。泡沫會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面變性，可能使染色質(zhì)損失在氣泡中。為了避免這種情況，一開始設(shè)為較低功率，再逐步提高。

8 在優(yōu)化條件時(shí)，每個(gè)超聲破碎循環(huán)后通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段的長度。剪切不足所產(chǎn)生大的不溶蛋白質(zhì):DNA:RNA復(fù)合物可能堵塞瓊脂糖凝膠的孔，并延緩電泳過程。通過消化蛋白質(zhì)、逆轉(zhuǎn)交聯(lián)、酚:氯仿提取和沉淀來純化DNA。

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